Обитатели земных глубин. О самых странных существах на планете - Карен Ллойд

Доставив образцы в лабораторию, мы первым делом должны физически отделить ДНК от всего остального, что попало в собранную нами жижу. Нам нужно удалить все жиры, сахара, белки, а также кусочки почвы и грязи. Затем мы разрушаем микробные клетки, чтобы ДНК вышла наружу, добавляем химические реактивы, чтобы она ни с чем не слипалась, а потом выделяем ее и очищаем. Существует несколько способов для решения каждой из этих задач, но у нас нет возможности проверять их все на каждом этапе, перебирая все возможные комбинации, поэтому, как только мы находим работающий метод, мы дальше пользуемся им и больше уже ничего не меняем. Мой коллега Костас Кормас из Университета Фессалии в Греции однажды безуспешно пытался выделить ДНК из образцов, отобранных из гидротермального источника, и в порыве бешенства прогрел их в микроволновке. К его изумлению, это сработало! А иногда, наоборот, известный метод оказывался совершенно непригодным: однажды я целое лето выделяла ДНК из образцов, пока не поняла, что всякий раз на последней стадии процесса, не осознавая этого, почти полностью выливала всю ДНК в раковину. Когда я это осознала, я заплакала, а потом собрала друзей в баре, чтобы попрощаться с результатами трехмесячной работы[16]. Вообще говоря, выделение ДНК – одна из наименее точных процедур в моей исследовательской деятельности, и когда я задумываюсь об этом, мне становится не по себе.

Когда в начале 2000-х годов я работала над диссертацией, каждый раз после процедуры выделения ДНК на следующем этапе мы неизменно проделывали хитроумный трюк с помощью бактерии Escherichia coli. Эта бактерия, кишечная палочка, которую обычно называют просто E. coli, часто попадает в организм человека с немытым салатом и может вызвать кровавый понос, рвоту и если не смерть, то острое желание умереть[17]. Она размножается со скоростью лесного пожара и умеет подбирать в окружающей среде гены, позволяющие ей ловко пробивать защиту нашей иммунной системы. Однако существуют штаммы E. coli, которые растут так же быстро и тоже поглощают гены из окружающей среды, но не могут нас заражать. Эти безвредные клетки благодушно соглашаются принять в себя последовательности чужой ДНК и создают миллионы ее копий, которые мы затем используем для секвенирования по методу Сэнгера. Этот подход называют созданием “библиотек клонов”, поскольку каждая последовательность ДНК происходит из отдельного клона E. coli.

Понятно, что если мы предоставим клеткам E. coli всю ДНК, выделенную из измельченных камней или подповерхностных жидкостей, то в результате получим разнородную смесь нужных и ненужных ДНК-фрагментов. Поэтому мы тщательно отбираем то, что давать E. coli. Чтобы выбрать из генетического бульона только один ген и получить достаточное количество его копий, мы сначала проводим ПЦР. Изобретение ПЦР сыграло важнейшую роль в революции исследований ДНК, поскольку это единственный способ получить достаточное количество молекул, чтобы с ними можно было работать. К сожалению, для проведения этой реакции необходимо много различных ферментов и мелких молекул. Если выделение ДНК вгоняет в депрессию, то ПЦР может сделать человека верующим. Я неоднократно видела аппараты для ПЦР, разукрашенные молитвенными флажками, маленькими алтарями или котиками, приносящими удачу. Вы спросите почему? Чтобы ПЦР сработала правильно, нужно выбрать из смеси ДНК один конкретный ген – это делается с помощью маленького фрагмента ДНК, называемого праймером, он состоит примерно из двадцати оснований. А еще нужна точно подобранная смесь компонентов и реагентов. Знаете, почему ПЦР может не получаться? Потому что в смеси слишком много соли, металлов и органических молекул. Знаете, почему еще ПЦР может не получаться? Потому что в смеси слишком мало соли, металлов и органических молекул. Создать идеальную среду для реакции невозможно по той простой причине, что невозможно извлечь идеально чистую ДНК из той сложной смеси веществ, где она содержится. Бывает даже, что сама ДНК мешает проведению ПЦР. Вот почему каждая попытка провести ПЦР как минимум отчасти обречена на провал, и остается только надеяться (или молиться), что в образце достаточно ДНК, чтобы преодолеть влияние всех ингибиторов[18].

Невзирая на все сложности и на периодические ночные кошмары, настигавшие нас в процессе амплификации генов с помощью ПЦР, их клонирования в клетках E. coli и секвенирования по Сэнгеру, метод работал достаточно хорошо, чтобы мы осознали: разнообразие микробного мира намного превосходит разнообразие всей видимой жизни на нашей планете¹. Однако такой подход имел свои ограничения. Прежде всего, он медленный. Мы были вынуждены описывать миллиарды микробных клеток, анализируя лишь несколько десятков последовательностей ДНК. Это все равно что описывать экологию дождевых лесов, наблюдая всего за четырьмя видами животных. Попытайтесь оценить общее число видов в дождевых лесах на основании списка, состоящего из двух видов деревьев, одного вида обезьян и одного вида лягушек. Это статистически невозможно.

Примерно в таком состоянии находились исследования в области экологии микроорганизмов в начале 2000-х годов. С помощью ПЦР-праймеров и библиотек клонов мы обнаруживали невероятное разнообразие видов буквально во всех средах и поэтому успокоились в ложной уверенности, будто знаем их все. Но мы нашли не всех существующих микробов, далеко не всех². Понять это нам помогла вторая революция в исследованиях ДНК.

Пока я корпела над созданием библиотек клонов, началось развитие многомиллиардной индустрии[19], вызванное необходимостью разработать более быстрые методы секвенирования большого количества ДНК с меньшим числом ошибок и с более низкой стоимостью в расчете на одно основание. Первый значительный прорыв сделала компания Roche, которая использовала метод так называемого 454-пиросеквенирования для получения десятков тысяч прочтений отдельной ДНК в образце. Этот метод открыл широкий путь для поиска новых видов микробов, поскольку научный прогресс больше не зависел от того, сколько колоний E. coli несчастный аспирант сумеет подцепить зубочисткой.

В середине 2000-х годов Джули Хьюбер и Митч Согин из Морской биологической лаборатории использовали новую технологию и определили последовательности генов примерно десяти тысяч микробов из литра океанской воды с большой глубины³. Чтобы вы поняли, насколько они опередили всех остальных, скажу, что в том же году я опубликовала статью с описанием генов примерно пятидесяти микробов из одного образца⁴. Джули и Митч осознали, что в морской воде содержатся тысячи микробов, которых нельзя обнаружить с помощью метода Сэнгера, поскольку их там очень мало. Каждый представитель этой так называемой редкой биосферы в подходящих условиях