Кошки, гены и эволюция - Павел Михайлович Бородин

Заметьте, Dominant White – это не еще один вариант альбинизма наряду с сиамским, бурманским и красноглазым. Эта мутация в совсем другом гене, который находится на совсем иной хромосоме (B1), чем ген альбинизма (D1). Она нарушает совсем иной путь развития окраски – не синтез пигментов, а наличие в коже клеток, предназначенных для синтеза пигментов.

Многообразие фенотипических эффектов разных мутаций гена KIT у разных видов млекопитающих вызывало жгучее любопытство исследователей: что там внутри этого гена? Начали, естественно, с мышей, но мы пока их пропустим и перейдем непосредственно к кошкам.

В виварии Университета Джонса Хопкинса белых кошек разводили не ради их красоты, а ради их глухоты, как модель человеческого недуга. Поскольку белый цвет и глухота явно определяли район поиска, то исследователи целенаправленно анализировали последовательности гена KIT у нормальных, пятнистых и белых котов из этой колонии²⁵.

Откуда они знали, где в геноме кошки находится KIT? Последовательность этого гена уже была определена у человека и мыши, и еще 328 видов животных. Определив общие – консервативные – районы KIT у шести видов млекопитающих, исследователи легко нашли его в геноме кота. Да и вы сами это можете сделать. Адреса – в сноске[18].

Затем исследователи сравнили последовательности KIT у нормальных, пегих и белых котов (рис. 2–1). У пегих котов (W^S/_) они увидели вставку чужеродной последовательности длиной в 7125 нуклеотидов в первом интроне. У белых котов (W/_) в том же месте был короткий фрагмент этой вставки. Всего 617 нуклеотидов.

В другом эксперименте другие исследователи обнаружили, что белоногость w^g вызывается совсем крошечной заменой – всего двух нуклеотидов²⁶. И не в интроне, а в экзоне. То есть эта рецессивная мутация меняла аминокислотный состав белка KIT, в отличие от описанных выше доминантных мутаций, которые, по-видимому, меняли время и место синтеза и количество наработанного белка. Мутация w^g немного ослабляла связь между белком KIT и белком, с которым он должен взаимодействовать, обеспечивая миграцию клеток. Мы бы сказали, что мелонобласты w^g/w^g иногда поскальзывались по пути к концам конечностей, но боимся, что нас обвинят в вульгаризации и профанации науки.

Как вы помните, KIT работает не только в меланобластах, но и у многих других производных нервного гребня. Не удивительно поэтому, что нарушения в структуре и регуляции этого гена могут вести к разным патологиям. Внеплановые включения этого гена, ответственного за пролиферацию и миграцию эмбриональных клеток, особенно опасны в клетках взрослого организма. Такие клетки начинают пролиферировать и мигрировать – становятся злокачественными. Активирующие мутации в этом гене связаны с опухолями желудка, кишечника и семенников, меланомой, острым миелоидным лейкозом. Такого рода мутации в KIT включены в программы геномного тестирования во многих ветеринарных лабораториях.

Что находится за границами гена KIT? Наверное, разные его регуляторы (энхансеры и сайленсеры). Раньше думали, что они могут находиться где угодно. Несколько лет назад возникло предположение, что регуляторы должны быть рядом с генами, которые они регулируют. Мало того, они должны быть надежно отгорожены от других генов и их регуляторов. Возникло это предположение благодаря открытию топологически ассоциированных доменов (ТАД)²⁷, внутри которых последовательности ДНК физически взаимодействуют друг с другом чаще, чем с последовательностями за пределами ТАДа.

ТАД можно сравнить с жителями одной квартиры. Кошка живет со своим котенком, в их же доме живет человек – это один ТАД, все его участники часто друг с другом контактируют. Иногда к человеку приходят гости, иногда кошка бывает у ветеринара – это редкие взаимодействия между соседними ТАДами. А вот на Шпицбергене кошка никогда не бывала (и, скорее всего, никогда не будет, потому что кошкам вход на Шпицберген запрещен) – разные хромосомы друг с другом почти никогда не контактируют.

Вскоре были определены средние размеры ТАД. Они варьировали от класса к классу в соответствии с вариациями общего размера генома. У млекопитающих они были втрое больше, чем у птиц, и в 10 раз меньше, чем у лягушек! Зато их границы оказались одинаковыми (если при сравнении учесть разницу размеров генома).

Зачем нужны ТАДы, до сих пор не очень понятно. Исследователи полагают, что важны даже не сами ТАДы, а границы на замке между ними. Взаимодействие регуляторов с промоторами разрешается только внутри ТАДа, а посторонним регуляторам вход категорически запрещен. Границы между домами (границы ТАДа) строго охраняются, чтобы чужак из соседнего дома не пришел и не стал давать указания жильцам не в своем доме (чтобы регулятор из одного ТАДа не включал/выключал гены в соседнем ТАДе).

Когда исследователи присмотрелись к клиническим случаям, оказалось, что нарушение границ ТАДа ведет к развитию рака, дефектам развития конечностей и мозга. Но это все были случаи спонтанных и, стало быть, нерегулируемых нарушений границ. В большинстве случаев вместе с границей оказывались нарушены и соседние с ней участки генома.

Сейчас наши коллеги из Института цитологии и генетики СО РАН, имея подробную карту ТАДов человека, разрабатывают алгоритмы для предсказания клинических эффектов разных хромосомных перестроек. Они же пытаются узконаправленно нарушать границы ТАДов у мышей. Это почти инстинктивное стремление любого исследователя при виде нерушимой границы: а давайте мы ее снесем и поглядим, что выйдет.

Наши коллеги решили снести границу того самого ТАДа, где у мышей находится ген KIT. А KIT заинтересовал их своим соседом по геному – KDR. Если представить геном в виде линии, то эти два гена расположены близко, точно друг за другом. Однако в пространстве ядра они контактируют нечасто и заключены в отдельные ТАДы. Это позволяет им иметь независимую регуляцию – в конкретном типе клеток независимо друг от друга нарабатывать белки. В меланоцитах или тучных клетках (иммунных клетках, известных своей ролью в воспалении и аллергии) KIT активен, а его сосед KDR неактивен. И наоборот, например, в выстилающих сосуды эндотелиальных клетках KIT неактивен, а KDR активен. А что будет, если границу ТАДа между KIT и KDR сломать?

Для взлома границы наши коллеги использовали геномную технологию CRISPR/Cas9²⁸, которая в народе называется геномными ножницами.

При встрече с ДНК перед CRISPR/Cas9 стоит две задачи: найти целевой участок и разрезать. Комплекс CRISPR/Cas9 состоит из короткой направляющей РНК, комплементарной целевому району ДНК, который нужно изменить, и белка Cas9, который разрезает ДНК точно в том месте, где прилепилась направляющая РНК. Если нам нужно удалить ген целиком, мы нацелим одну направляющую РНК на его начало, а другую –